在11月8日，賽分科技聯合生物制品圈開展“ADC藥物的分析方法開發”線上直播交流活動，本次直播對ADC藥物關鍵質量屬性（CQA），ADC藥物的不同檢測方式（包含體積排阻色譜檢測ADC及抗體片段、聚體，疏水作用色譜對ADC藥物DAR值檢測，離子交換對電荷異質性的分析，反相色譜對ADC藥物純度的檢測等），及其分析方法優化的途徑進行了介紹。直播間各位觀眾積極提問，主講人結合自己豐富的實戰經驗及技術積累，做了解答。在此，我們摘錄部分提問，與各位分享。
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精選問答
1. SEC色譜柱使用有機試劑作為流動相，是否會導致SEC色譜柱壽命縮短？
答：硅膠基質的色譜柱可以耐受70%的有機相，如果色譜柱使用有機相體系，那么減少切換鹽相的更換頻率對延長色譜柱的壽命是有利的；另一方面，在使用色譜柱時注意它的一個保存和維護，硅膠基質的SEC色譜柱在日常維護可以采用6 M鹽酸胍，單針進樣清洗，另外長期保存的條件建議是50 mM磷酸鹽緩沖液pH 7.0 ，含0.02%疊氮化鈉或者50 mM 磷酸鹽緩沖液pH 7.0，含 20%乙腈。合理的維護和保存可以延長色譜柱的使用壽命。
2. 在檢測ADC樣品中游離藥物時，應當如何進行樣品前處理？
答：在做ADC藥物的游離小分子檢測時，可以通過乙腈蛋白沉淀，復溶之后再檢測；另外也可以不做變性處理采用SEC色譜柱進行直接檢測，80Å孔徑的Zenix-C SEC-80，可以排阻大分子樣品，成功與游離小分子分離，實現快速分析。
3. 針對高DAR值的ADC樣品進行SEC檢測時，發現主峰前延的情況，可以通過什么方法改善分離效果？
答：首先考察色譜柱性能是否正常，采用標準蛋白或者驗證過的樣品去測試，確認色譜柱拖尾因子是否在正常范圍內；如果色譜柱性能正常，那么出現主峰前延的情況下，應該是樣品和色譜柱有一定的非特異性吸附，考慮在流動相和稀釋液中加入一定比例的鹽或者有機相去改善次級相互作用。在優化的時候，加入有機相的同時，注意鹽不要析出，另外關注儀器壓力，加入一定有機相的時候需要相對的降低流速，在升高流速的時候更小梯度的逐步升高。
4. 在做抗體連接熒光小分子（蛋白），采用HIC方法分離，連接后發現ADC樣品峰響應值低，無法分離出，該怎么進行優化？
答：關注該方法采用的檢測器，對于含熒光分子的檢測，優先考慮采用熒光檢測器（FLD）。再通過對比連接色譜柱和不接色譜柱的信號差異，如果發現前后差異很大，可能色譜柱存在吸附問題；對于色譜柱吸附，可以在流動相中加入一定比例的有機溶劑，降低次級相互作用。如果通過加入有機溶劑的方式收效甚微，那考慮是否由于疏水作用色譜較強導致，可能需要更換疏水性相對較弱的色譜柱再進行嘗試。
5. 離子交換色譜多孔和無孔的差異體現在哪些方面？
答：色譜填料是否有孔的差異主要體現在比表面積的差異，有孔的填料相對而言具有更大的比表面積，相對而言它的載量會更高。此外，填料孔徑的大小和樣品分子大小的相對關系，對分離也有影響。無孔填料是在其微球表面鍵合基團，可以通過延長間隔臂，減小空間位阻，增加填料所能結合的官能團，從而提高載量。但對于分析色譜柱而言，載量不是色譜填料考慮的優先因素，所以對于分析柱而言載量小不會對分析有什么影響。
6. 對于離子交換分離，請問pH洗脫和鹽梯度洗脫的各自優缺點有哪些？
答：對于離子交換的兩種洗脫模式，其主要區別在于：pH洗脫優勢在于快速，對分析方法優化比較快，嘗試幾個梯度就可以得到比較好的結果，而它的缺點在于選擇性相對較少，商用的pH試劑較少，可優化的范圍也相對較窄；鹽梯度洗脫的優勢在于可以多角度、多方向進行優化，可以調整鹽的種類、鹽濃度，并且對不同樣品的選擇性可以有一些明顯的改善效果，鹽梯度分析優化的不足在于其分析方法優化更為復雜，對于實驗操作而言需要配制不同鹽以及不同濃度的鹽，相對繁瑣。
7. 對于ADC藥物DAR值分析的時候，對于峰歸屬問題怎么解決？
答：根據ADC藥物結構可得，抗體可通過連接子接入不同個數（0~8個）的細胞毒分子，需要對不同的色譜峰進行歸屬確認，最后可以得到該ADC樣品的平均DAR值。如果分析的時候采用HIC模式進行分析的，那么該方法通常采用較高的鹽濃度作為流動相，不利于直接連接質譜檢測，可以考慮將不同的色譜峰收集，在進行LCMS的檢測，更有利于確定不同的色譜峰。另外也可嘗試采用RP的分離方式去進行峰分離和檢測，有利于MS兼容。
ADC藥物結構示意圖
8. 請問為什么pl>7的抗體ADC更多選擇陽離子交換？強陽和弱陽離子交換應該怎么選擇？
答：一般對于樣品pI（等電點）大于7，優先選擇陽離子色譜柱分離；強陽和弱陽離子的交換官能團是不同的，弱陽通常是羧酸基團，強陽是磺酸基團，對應不同的pKa值，因而對于不同樣品的選擇性也不同。對于弱陽交換的離子色譜，在流動相pH與固定相pKa相差2個單位的時候它的選擇性相對更好。離子交換色譜的選擇是兩方面考慮的，即流動相pH和樣品pI，流動相的pH值比樣品pI小的時候，采用陽離子交換；流動相的pH值比樣品pI大的時候，采用陰離子交換。實際分析時還需要注意ADC樣品在不同pH值的穩定性，注意避免引起Linker的斷裂。
9. ADC藥物進行疏水色譜分析時，樣品需要使用流動相A（高鹽流動相）稀釋嗎？
答：在進樣前，需要確認溶劑對樣品疏水性的影響，一般會用高鹽（流動相A）溶解或者稀釋樣品，以增加進樣前樣品的疏水性，避免樣品直接流穿；另外需注意樣品在高鹽時可能會產生沉淀，可以通過預實驗（進樣前將樣品用流動相A稀釋一下，看是否產生沉淀）進行驗證，如果產生沉淀，建議將流動相A的濃度降低些。
10. 請問在選擇SEC柱子系列的時候，要考慮抗體或者ADC的哪些特性？才能避免盲目選擇？
答：對于SEC的選擇主要有三個點，其一，就是填料孔徑的選擇，主要與ADC分子量或者分子尺寸直接相關，明確它的排阻限；其二，考慮填料的粒徑和色譜柱的尺寸規格，同等孔徑規格下，更小粒徑色譜柱可以帶來更高的分辨率；第三個方面，考察色譜柱與樣品的一個非特異性吸附問題，賽分科技可以提供超低非特異性吸附的色譜柱，可以選擇SRT-C/Zenix-C/Unix-C系列的色譜柱產品用于ADC類疏水性較高的藥物進行分析。
11. ADC測DAR值HIC法系統適用性如何設定？
答：ADC樣品DAR值分析系統適用性的確定主要關注ADC樣品的DAR值及RSD的測試情況，顯示不同DAR值的峰需要在系統適用性樣品中體現，此外根據RSD確定該色譜峰的重現性。對于色譜峰分離度及柱效需要結合具體的樣品考察，前期研究的時候可以重在積累數據，之后再確定一個合適的分離度和柱效的標準。
本次直播感謝各位觀眾的熱情參與，
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